El servicio de Análisis Celular y Metabólico del IBGM consta de un lector de placas multimodal con análisis de imagen Cytation 5 de Agilent-BioTek y un analizador metabólico en tiempo real Seahorse XFe24 de Agilent.

Los equipos son complementarios en el tipo de ensayos celulares que realizan y su metodología y software son compatibles entre sí. La conexión entre ambos sistemas, permite que los datos metabólicos obtenidos en los ensayos XF sean normalizados usando Cytation 5 para realizar el recuento automático de células en las placas de Seahorse.

1.Descripción de los Equipos:

Cytation 5 de Agilent-BioTek:

El lector de placas multimodal con análisis de imagen en tiempo real Cytation 5 es un equipo de alto rendimiento que combina la microscopía automatizada con la detección en microplacas convencionales en una única plataforma.

Su módulo de lectura incluye dos sistemas de detección, mediante monocromador y mediante cubos de filtros, que permiten realizar medidas de absorbancia, intensidad de fluorescencia, fluorescencia polarizada, TRF (time-resolved fluorescence), luminiscencia, detección Alpha y ensayos con sondas metabólicas (MitoXpress y pH-Xtra Glycolysis).

Su módulo de microscopía ofrece adquisición de imágenes con magnificaciones de 4x, 1ox, 20x, 40x y 60x en tres canales de fluorescencia (DAPI, GFP y Texas Red), campo claro, campo claro a color y contraste de fases digital. Además, está equipado con un sistema de control de temperatura, un sistema de control de gases (CO₂/O₂), un sistema dual de inyección de reactivos y un sistema de agitación interno que asegura que los reactivos inyectados estén correctamente mezclados antes de cada lectura. Cytation 5 permite llevar a cabo todo tipo de ensayos como, ensayos de actividad enzimática, calcio intracelular, expresión génica, ensayos de viabilidad, proliferación y muerte celular, etc., tanto en células fijadas o tejidos ex vivo (explantes) como en células y pequeños organismos vivos (tipo C. elegans).

Seahorse XFe24 de Agilent::

El analizador metabólico Seahorse XFe24 mide la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células en cultivo o muestras ex vivo en un formato de microplaca de 24 pocillos. Los valores de OCR y ECAR/PER (Proton Efflux Rate) son indicadores de la respiración mitocondrial y de la glucólisis, y permiten estimar la tasa de producción de ATP celular.

Seahorse XFe24 utiliza un sistema de cartuchos con sondas de fibra óptica sensibles a oxígeno y protones, y puertos de inyección integrados que permiten la adición y mezcla automática de hasta cuatro compuestos en cada pocillo. Puede analizar todo tipo de células, incluyendo cultivos primarios, líneas celulares, células en suspensión, islotes pancreáticos, esferoides celulares, C. elegans, levaduras y mitocondrias aisladas, de forma no invasiva y sin necesidad de emplear ningún tipo de marcador.

El equipo permite generar diferentes protocolos para estimar parámetros relevantes para el metabolismo energético celular como, por ejemplo, la actividad de los diferentes complejos respiratorios, el grado de utilización de diferentes sustratos energéticos (azucares, aminoácidos, grasas) o el grado de acoplamiento/desacoplamiento de la respiración mitocondrial a la síntesis de ATP.

2. Normas de funcionamiento:

Normas generales:

• El técnico responsable del servicio controlará las reservas y supervisará todas las actuaciones de ambos equipos por el personal del IBGM, para asegurar un correcto funcionamiento.
• No se permite la utilización de ninguno de los dos equipos a personas ajenas al IBGM.
• Todas las personas del IBGM usuarias del servicio deben conocer y seguir las instrucciones de uso de los equipos. Los manuales de uso de los equipos están disponibles en formato pdf en la intranet del centro.
• No está permitido hacer cambios en las configuraciones generales o partes de los equipos sin la autorización del técnico responsable.
• Debe dejarse constancia clara del uso del equipo en los cuadernos de registro anexos a los equipos, incluyendo siempre el nombre y laboratorio de cada usuario, así como el tiempo de utilización.
• Tanto los equipos como las áreas de trabajo de los mismos deben mantenerse y dejarse limpias para el siguiente usuario.
• Cualquier incidencia, daño, desperfecto o fallo que se observe en el equipo debe ser comunicado al técnico responsable.
• Serán responsabilidad del usuario los daños producidos en los equipos debido a un mal uso de éstos y/o por incumplimiento de estas normas generales, en todos sus apartados.

Comunicación y publicidad de las ayudas a la financiación de los equipos del servicio:

Según la reglamentación sobre cofinanciación por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), que afecta a ambos equipos, los usuarios deberán cumplir con las disposiciones en materia de comunicación y publicidad establecidas en las respectivas convocatorias, añadiendo en todo tipo de publicaciones que resulten de su utilización la referencia de sus respectivos proyectos:

-Cytation 5: EQC2019-006686-P (MCIN/AEI, FEDER)
-Seahorse: IR2020-1-UVA05 (JCyL, FEDER)

Gestión de los residuos del Seahorse XFe24:

Los principales residuos generados por el uso de este equipo son los cartuchos de plástico y los tóxicos rotenona, antimicina y oligomicina (residuos líquidos).

Ambos tipos de residuos deben ser separados tras finalizar los ensayos XF y almacenados para su posterior recogida por la empresa que gestiona el tratamiento de los residuos en la Universidad.

• Los compuestos tóxicos deben ser retirados de los cartuchos y recogidos en el bote situado al lado del equipo.
• Tras retirar los residuos líquidos, los cartuchos deben ser almacenados en el contenedor situado bajo la poyata donde se encuentra el equipo.

Almacenamiento de archivos en los ordenadores de los equipos y transferencia a otros dispositivos:

• El almacenamiento de archivos de datos e imágenes en los ordenadores de los equipos es temporal. Se realizará una limpieza de archivos anual y, adicionalmente, cuando sea necesario por falta de espacio de almacenamiento en los discos duros de los ordenadores. Se avisará con suficiente antelación a los usuarios de la eliminación de los archivos vía mail.
• La transferencia de los archivos a otros dispositivos es responsabilidad de los usuarios. Para ello se recomienda:
• En el caso del Cytation 5, usar las carpetas compartidas en red.
• En el caso del Seahorse XFe24, usar la plataforma Seahorse Analytics.

En ambos casos, es aconsejable evitar el uso de pendrives u otro tipo de dispositivos de almacenamiento extraíbles siempre que sea posible, para prevenir posibles problemas de malware.

3. Reservas:

• Los usuarios internos deben realizar sus reservas a través de la intranet del centro, con al menos un día de antelación en caso de necesitar apoyo técnico del responsable del equipo.
• Los usuarios externos al IBGM primero deben contactar con los responsables del servicio para solicitar y planificar el uso de los equipos. Después, para formalizar la reserva:
  • En el caso del Cytation 5, será necesario cumplimentar y enviar al responsable técnico el formulario de Prestación de Servicio Externo.
  • En el caso del Seahorse XFe24, al ser un equipo que pertenece a la red de Equipamiento Científico-Tecnológico Compartido en Castilla y León (INFRARED), su reserva debe realizarse directamente a través del portal INFRARED: INFRARED de JCyL.

4. Tarifas:

• Las tarifas para el uso del Cytation 5 son las siguientes:

UVa/CSIC/OPIS/ E. PUBLICAS	30 €/hora
E. PRIVADAS	60 €/hora

• Las tarifas para el uso del Seahorse XFe24 son las siguientes* (las mismas que figuran en el portal INFRARED):

	AutoServicio	Con apoyo técnico
Universidades de Castilla y León	1 €/hora	5 €/hora
CSIC/OPIS/ E. PUBLICAS	A consultar	10 €/hora
E. PRIVADAS	A consultar	20 €/hora

*Las tarifas incluyen el uso del incubador sin CO₂

• A todas las tarifas hay que sumar el 21% de IVA.

De forma general, la preparación de las muestras es responsabilidad de los usuarios.  

Se puede consultar a los responsables del servicio la posibilidad de disponer de ayuda en la preparación de las muestras o, en el caso de los usuarios externos, la necesidad del uso de otras instalaciones del centro como pueden ser las salas de cultivo, con el correspondiente incremento en la tarifa contratada.

5. Reconocimiento al trabajo del servicio:

Reconocer de forma adecuada al servicio en las publicaciones, es una medida importante de la satisfacción de los usuarios, contribuyendo a su prestigio, a la mejora de su calidad y también a la motivación de su personal. Además, es necesario para el cálculo de las estadísticas e índices de productividad que son requeridos por las entidades financiadoras de los equipos.

De este modo, se pide a los usuarios que informen al personal del servicio de todas las publicaciones que incluyan datos obtenidos mediante el uso de cualquiera de los equipos. Dichas publicaciones deberán:

1. Reconocer al servicio como un todo, para que quede constancia de su participación en ese trabajo. Ejemplo: “We acknowledge the Cellular and Metabolic Analysis Facility at the unit of Excellence Institute of Biomedicine and Molecular Genetics (IBGM), University of Valladolid-CSIC, Spain, for providing equipment / services / expertise / assistance…”.
2. Reconocer la labor individual de los miembros del servicio, en función de la contribución realizada:  Cualquier contribución sustancial de los miembros del servicio, más allá de un trabajo de rutina o básico, debería ser reconocida mediante la co-autoría en las publicaciones resultantes

Se recomienda consultar la GUÍA DE RECONOCIMIENTO que se muestra a continuación y ponerse de acuerdo con los miembros del servicio antes de enviar el manuscrito

6. Personal y contacto:

• Responsable Técnico:

Silvia Patricia Fernández Martínez, PhD

IBGM (Edificio Benito Herreros) 2ª planta-Laboratorio D2

Email: silviapatricia.fernandez@uva.es Tfno: 98318-4820

• Responsable Científico:

Jaime Santo Domingo Mayoral, PhD

IBGM (Facultad de Medicina) 5ª planta-Despacho C2

Email: jaime.santo-domingo@uva.es Tfno: 98318-6871